細胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學(xué)會清洗、消毒方法是從事細胞培養(yǎng)工作必須的。

一、清洗 離體條件下，有害物質(zhì)直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達到不含任何殘留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。

1、浸泡:新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。

2、刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

3、浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要小心。

4、沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空"15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。

（二）橡膠制品清洗

新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特點：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。

（四）包裝:對細胞培養(yǎng)用品進行消毒前，要進行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進行局部包扎。

二、消毒和滅菌 微生物污染是造成細胞培養(yǎng)失敗的主要原因

（一）物理消毒法

1、紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力*。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2－3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長照射時間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應(yīng)超過1.5米，照射時間30分鐘為宜。

紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。

2、高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆茫駝t，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。

3、高溫干熱消毒：干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90－120分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。

干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。

燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。

4、過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。

（二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1％水溶液可對器械、皮膚、操作表面進行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時的“急救"方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。

可用于細胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣；多用新潔而滅消毒實驗室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。

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qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。